Virus pod mikroskopom: od slikanja do manipulacije

Virus pod mikroskopom: od slikanja do manipulacije

Denis Kornejev
"Science First Hand" št. 3/4 (57/58), 2014

Virusi so izredno majhni predmeti, ki segajo v velikosti od nekaj deset do nekaj sto nanometrov. Prva in več desetletij je bila edina metoda njihove vizualizacije elektronska mikroskopija, ki je omogočila ne le podrobno proučevanje strukture samih virusnih delcev, imenovane virions, temveč tudi raziskovanje procesov, ki se pojavljajo v okuženi celici – replikacijo virusa. "Monopol" elektronske mikroskopije je bil v zgodnjih osemdesetih letih prejšnjega stoletja prekinjen s popolnoma novim sklopom naprav – skenirnih sondnih mikroskopih.

Mikroskop za atomsko silo, ki spada v ta razred, se je izkazal za orodje, primernega za preučevanje bioloških predmetov in ne samo za vizualizacijo nanodelskih struktur, ampak tudi za manipulacijo z njimi. Zlasti je bilo v osnovi mogoče izvesti manipulacijo posameznih virionov in neposredno merjenje sile, ki izhajajo iz njihovega stika s celično površino. Takšni poskusi omogočajo pridobitev podrobnih podatkov o prvi in ​​v mnogih primerih še vedno nezadostno preučenih stopnjah okužbe celic – adhezijo virusa na njegovo površino.Te študije imajo precejšen praktični pomen, saj lahko zagotovijo ključ za ustvarjanje učinkovitih protivirusnih zdravil, ki ščitijo celice pred virusi penetracije.

O avtorju

Denis Vladimirovič Korneev – raziskovalec, Laboratorij za ultrastrukturne raziskave, predsednik sveta mladih znanstvenikov Državnega znanstvenega centra Virologije in biotehnologije "Vector" (Novosibirska regija, Koltsovo). Avtor in soavtor 11 znanstvenih člankov.

V slavni pesmi Vladimirja Vysotskega se peva: "… ne boš dobil nevtrino za brado in ne boš ga postavil v epruveto …". Seveda virus ni neutrino, ne atom ali celo molekula, temveč še vedno tako majhen predmet, da ga ne moremo videti samo z očesom, ampak tudi z običajnim svetlobnim mikroskopom. Vendar pa je elektronska mikroskopija, ki je več sto tisočkrat povečala zmožnosti naše vizije, omogočila ne le videti teh neverjetnih predmetov, temveč tudi, da jih preučimo do najmanjših podrobnosti. In mikroskopija atomske sile, ki je enako osterila naš občutek dotika, nam je omogočila neposredno mehanično manipulacijo z virusnimi delci.

Virusi so zelo majhni predmeti – njihova velikost je od nekaj deset do nekaj sto nanometrov. Prvi in ​​dolgo časa je bila edina metoda neposredne vizualizacije delcev nanodelcev elektronska mikroskopija (EM), ki se je začel razvijati v tridesetih letih 20. stoletja. Metoda, ki se je izkazala za zelo informativno, je omogočila ne samo podrobno opisati strukture različnih virusov, temveč tudi raziskati procese, ki se pojavljajo v okuženi celici.

Izkazalo se je, da se oblika virusnih delcev razlikuje po velikem raznolikosti: od rednih kroglic do zapletenih struktur, ki spominjajo na opeke, lepljene s tubulami (virusom variola) ali z bristly črvi (virusa hemoragične mrzlice Ebole).

Za strategijo je bila ugotovljena večja raznolikost ponovitve (razmnoževanje) virusov. Edina temeljna lastnost, ki je skupna vsem virusom brez izjeme, je bila status obveznega znotrajceličnega parazita. To pomeni, da se mora virus, da bi se razmnožil, moral njegov genetski material nujno prodreti v živo celico in "zajeti" njegov encimski aparat, s tem pa se preklopi na kopiranje virusa.

Vsak virus je zunaj celice samo molekularna posoda z genskim materialom (DNA ali RNA) in je težko šteti za polnopravni živi organizem, čeprav v znanstveni skupnosti še vedno ni dokončne terminološke gotovosti.

Specifičnost elektronske mikroskopije je študija določen, to je objektov, pripravljenih na poseben način – dejansko deluje le s smrtno snovjo*. Raziskovalec ima le "zamrznjene trenutke" le hipoteze o dinamiki proučevanih procesov, saj v realnem času ne more opazovati njihovega pretoka.

Tako je študija replikacije virusa s transmisijsko elektronsko mikroskopijo na ultratinih odsekih naslednja: okužene celice obdelamo s fiksirno raztopino, dehidriramo z alkoholom in vlijemo s posebno smolo. Ko je smola utrjena s posebno napravo, se izdelajo ultratomni ultratinski (≈ 50 nm) profili, ki se nato nanesejo na posebno mrežico in obdelajo s težkimi kovinskimi solmi. Med samim mikroskopskim pregledom je vzorec v vakuumski komori in je izpostavljen elektronskemu žarku.z energijo več deset tisoč keV. Očitno je, da je v tem primeru intravitalno slikanje v osnovi nemogoče.

Elektronska mikroskopija je že skoraj pol stoletja ostala edina metoda za vizualizacijo nanosnih objektov. Vendar pa v zgodnjih 1980-ih. ta monopol je bil prekinjen s prihodom skeniranje sondne mikroskopije (SPM). Glavno načelo SPM je skeniranje – natančnost (z natančno natančnostjo) premikanje sonde pri površini, ki se preučuje, skupaj s sledenjem določenega parametra, ki označuje interakcijo med sondo in vzorcem. Rezultat tega skeniranja je topografska karta površine vzorca.

Prva naprava SPM je postala skeniranje tuneling mikroskop (STM), ki bi se lahko uporabljali le zelo malo za vizualizacijo bioloških predmetov, saj je bilo njegovo delo zahtevano za visoko električno prevodnost površine, ki se preučuje.

Leta 1986 je švicarski fizik G. Binnig in njegovi kolegi ustvarili novo napravo družine SPM – atomski silo mikroskop (AFM). Osnova njegovega dela je moč (Van der Waals) interakcije atov sonde in površine.AFM ne zahteva električne prevodnosti površine vzorca in lahko opravlja preglede v tekočem mediju. Zato se je ta pripomoček izkazal za priročno orodje za preučevanje bioloških predmetov.

Shematski diagram mikroskopa atomske sile (AFM). Občutljiv element AFM je elastična konzola (konzola), na koncu pa je pritrjena akutna sonda. Sile, ki nastajajo med atomi konice sonde in površino, ki je pod nadzorom, povzročajo deformacijo konzole, ki pa je fiksirana s pomočjo optičnega sistema, ki se izvaja v večini sodobnih AFM na osnovi polprevodniškega laserja in fotodetektorja s štirimi deli. Velikost konzole je 100 ÷ 300 × 20 ÷ 40 mikronov z debelino približno 2 mikrona. Višina sonde – približno 10 mikronov

Od pojava atomskega sila mikroskop, je bilo objavljeno veliko število dokumentov o slikanju AFM različnih bioloških vzorcev. Vendar pa je treba priznati, da v večini primerov AFM v primerjavi s konvencionalno elektronsko mikroskopijo ne zagotavlja ničesar novega, zato ga biologi pogosto zaznavajo kot tehnične eksotike in ne kot polnopravno raziskovalno orodje.

Vendar pa je najpomembnejša, čeprav skorajda edina prednost vizualizacije bioloških objektov, ki uporabljajo AFM v primerjavi z elektronsko mikroskopijo, sposobnost opravljanja raziskav na naravnih, naravnih vzorcih brez kakršne koli fiksacije in posebne priprave vzorca s fiziološkimi parametri okolja.

Poleg vizualizacije reliefa na površini z ločljivostjo subnanometra, AFM omogoča neposredno merjenje sile, ki izhajajo iz interakcije posameznih nanosnih objektov.

Takšne meritve izvedemo na naslednji način: na vrhu AFM sonde je pritrjen en predmet, drugi pa je pritrjen na podlago, po katerem se sondo prinese na površino podlage, dokler se ne doseže mehanski kontakt, nato pa se vrne. Med tem gibanjem je deformacija elastične konzole (konzola). Pokliči se odvisnost tega parametra od razdalje med sondo in substratom krivulja sile. Z njeno pomočjo je mogoče določiti obseg sile, ki deluje med predmeti v študiji. Ta metoda, imenovana atomska sila spektroskopija (ACC) lahko uporabimo za proučevanje močnostnih značilnosti interakcije številnih majhnih predmetov: od anorganskih nanodelcev do virusov in živih celic.

Metoda atomske sile spektroskopije omogoča določanje velikosti sile, ki deluje med preučevanimi predmeti. Če želite to narediti, je na vrhu sonde AFM določen en predmet, drugi pa je pritrjen na podlago. Sonda se nanese na površino substrata in se nato dvigne nazaj. Odvisnost deformacije konzole na razdalji med sondo in substratom imenujemo krivulja sile.

Začetna stopnja okužbe celice z virusom je adhezija (lepljenje) virusa delcev (virion) na površino celice, čemur sledi penetracija genskega materiala virusa v celico. Ta proces, ki ga določajo interakcije beljakovinskih receptorjev na površini celice s površinskimi proteini viriona, je ključnega pomena za razmnoževanje virusa. In, je treba opozoriti, v večini primerov, ni dovolj raziskati.

Resnično vznemirljive možnosti za raziskave v tej smeri odpirajo ACC.Z določitvijo posameznega virusnega delca na konici sonde AFM je mogoče izmeriti silo, ki se pojavi, ko se virusni delec dotakne površine celice, preučuje kinetične lastnosti te interakcije in celo pritisne virion znotraj celice, hkrati pa opazuje z močnim svetlobnim mikroskopom. V takem poskusu se raziskovalec iz pasivnega opazovalca pretvori v aktivni udeleženec v procesu, ki opravlja mehansko manipulacijo nanometrskega objekta, ki je predmet študije – nobena druga vrsta mikroskopije ne more zagotoviti takšne priložnosti.

Vendar je določitev enojnega virusnega delca na konici sonde za atomsko silo mikroskop zelo težka naloga. Za uspešen preizkus je potrebno veliko pripravljalnega dela:

  • dobili najčistejše in najbolj koncentrirane priprave virusa;
  • na konico sonde pripravite primerno pristajanje velikosti za pristajanje virionov;
  • kemično aktivira površino sonde, da tvori kovalentne vezi ob stiku z virusnimi proteini;
  • poskrbite, da je virion resnično pritrjen na sondi in ne prostih proteinskih molekul ali delcev majhnih celic, ki so vedno prisotni pri pripravi virusov.

Vrednotenje koncentracije in čistosti virusa zdravil se navadno izvaja s prenosno elektronsko mikroskopijo. Blazinica na konici sonde AFM, ki je ponavadi narejena iz silicija ali njegovega nitrida, se tvori z dolgoročnim skeniranjem silicijevega ali safirnega podlage za velike vrednosti pomika in pritisne sile sonde na površino. Najbolj grafična ilustracija tega postopka je sprememba oblike svinčnika med intenzivno risbo.

Ustrezna metoda spremljanja geometrijskih parametrov mikroskopa atomske sonde sonde (a) pri izdelavi mesta za pristajanje virionov je elektronska mikroskopija, tako skeniranje kot prosojnost:b – platforma na konici sonde za sajenje velikega virusa delcev; v – delec, podoben virusu, pritrjen na konico sonde. Prenosna elektronska mikroskopija (JEM 1400, Jeol, Japonska)

Glavno vprašanje, na katerega je treba odgovoriti pri razlagi rezultatov spektroskopije atomske sile, je mogoče formulirati na naslednji način: "Sile med merjenimi predmeti"

Po standardih mikroskopije,celica višjih organizmov je sorazmerno velik (≈ 10 μm) predmet, zato je jasno viden v svetlobnem mikroskopu, s pomočjo katerega je namenjen konzolni atomski silo. Kaj pa sama sonda, na vrhu katere naj bi bil virion prisoten? Stroglo rečeno, namesto viriona je lahko nekaj: monoslojna molekula beljakovin, fragment celice ali viriona, agregat več virionov, naključna kontaminacija itd. Poleg tega lahko virion med umerjanjem uniči ali odstrani od sonde. Vendar pa je vizualizacija sonde z virusnim delcem z elektronsko mikroskopijo pred meritvami moči nesprejemljiva, saj bo pod vplivom sušenja, vakuuma in elektronskega žarka virion dobil nepopravljive spremembe.

Najučinkovitejša metoda za reševanje tega problema je bila vizualizacija konice sonde AFM z elektronsko mikroskopijo, izvedeno takoj po meritvah sile. Če najdemo delec virusa na vrhu, ki je preživela poskus, potem bodo vsi dvomi izginili.

V zadnjih petdesetih letih, kot posledica resnično titanskega dela, ki ga izvajajo elektronski mikroskopi po vsem svetu,Na področju ultrastrukturnih vidikov replikacije različnih virusov se je nabralo ogromno znanje. Oblikovanje mikroskopa z atomsko silo in tehnika sile-spektroskopije je omogočilo tesno prilagajanje samovoljnih mehanskih manipulacij z enim virusnim delcem. To prinaša študijo interakcije virusa s celico na temeljito drugačno raven – od strukturnih do funkcionalnih študij.

Hkrati atomska sila spektroskopija ni konkurent za elektronsko mikroskopijo, temveč odpira novo neodvisno raziskovalno smer – nanomahiko interakcije delcev virusa s površino celice. Zelo verjetno je, da bodo v bližnji prihodnosti temeljna odkritja v tej smeri sorazmerna z dosežki elektronske mikroskopije sredi prejšnjega stoletja.

Študija povezovalnih mehanizmov virusnih delcev s celično površino je precejšen interes ne le s stališča osnovne znanosti, ampak tudi v kontekstu praktičnih aplikacij. Podrobnejše razumevanje teh mehanizmov na molekularni ravni lahko človeštvu dajo ključ do ustvarjanja učinkovitih protivirusnih zdravil,zaščita celic pred virusi.

Publikacija je uporabila avtorjevo fotografijo

Literatura
1. Korneev D.V., Bessudnova E.V., Zaitsev B.N. Študija interakcije nanodelcev TiO2 in površino človeških eritrocitov z atomsko silo spektroskopijo // UNZH. 2012. št. 4. str. 73-77.
2. Mironov VL Osnove skeniranja sondne mikroskopije. Nizhny Novgorod: IPM RAS, 2004. 182 str.
3. Alsteens D., Pesavent E., Cheuvart G. et al. Nadzorovana manipulacija bakteriofagov s spektroskopijo enojirusne sile // ACSNANO. 2009. V. 3 (10). Str. 3063-3068.
4. Alsteens D., Trabelsi H., Soumillion P., Dufren Y. F. Multiparametrična atomska sila mikroskopija slikanje posameznih bakteriofagov, ekstrudiranih iz živih bakterij // Naravna komunikacija. V. 4. Številka artikla: 2926.
5. Binnig G., Quate C. F., Gerber Ch. Mikroskop za atomsko silo // Fiz. Rev. Lett. 1986. V. 56 (9). Str. 930-933.
6. Cappella B., Dietler G. Sile krivulje razdalje z atomsko silo mikroskopijo // Surf. Sci. Rep. 1999. V. 34. str. 1-104.
7. Malkin A.J., Plomp M., McPherson A. Razpršitev atomske sile mikroskopija // Metode Mol. Biol. 2005. V. 292. str. 85-108.


* Prenosna elektronska mikroskopija s pomočjo posebne tekoče celice in optično elektronsko mikroskopijo pri atmosferskem tlaku omogoča, da bi raziskovali biološke predmete brez fiksacije, vendar se zaradi številnih tehničnih težav in sorazmerno nizke prostorske ločljivosti teh metod ne pogosto uporabljajo.


Like this post? Please share to your friends:
Dodaj odgovor

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: